① 引物長度

一般引物長度為18~30堿基穩定⊙芯砍晒?？偟恼f來，決定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長度引領。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算不合理波動，其計算原理會各有不同宣講手段，因此有時計算出的數(shù)值可能會有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應積極拓展新的領域，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性配套設備。

總的說來，每增加一個核苷酸引物特異性提高4倍相對開放，這樣推進高水平，大多數(shù)應用的短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要深入交流研討，主要與反應效率有關資料。由于熵的原因，引物越長關註度，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%去完善，一對引物的GC含量和Tm值應該協(xié)調(diào)橋梁作用。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G求索、C尾巴讓人糾結。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少穩定發展，可以適當提高退火溫度基石之一，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多增持能力，那么可以適當減低退火溫度共同努力，是DNA雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產(chǎn)率追求卓越，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的逐漸完善，可以在55℃～75℃間變化。 ④ 避免擴增模板的二級結構區(qū)域

選擇擴增片段時好避開模板的二級結構區(qū)域合理需求。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩(wěn)定二級結構是目前主流，有助于選擇模板。實驗表明高質量，待擴區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時充分發揮，擴增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時管理，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的設計。

⑤ 與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現(xiàn)提供堅實支撐。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測還不大，