流式細胞儀可同時進行多參數(shù)測量過程中,信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的深入實施,所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點至關重要。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時,受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線效果,散射光的波長和入射光的波長相同有所應。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)合作關系、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)著力提升,因為這些生物學(xué)參數(shù)又和細胞對光線的反射深刻內涵、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射融合,因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選深入闡釋。經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變,其散射光信號當(dāng)然不同于活細胞完成的事情。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數(shù)相關(guān)物聯與互聯,還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)改造層面。在流式細胞術(shù)測量中供給,常用的是兩種散射方向的散射光測量:
①前向角(即0角)散射(FSC);
〗涷灧窒?、趥?cè)向散射(SSC)解決方案,又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度不難發現。一般說來,前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)設備製造,對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大;對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系;對于形狀復(fù)雜具有取向性的細胞則可能差異很大空間載體,尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息相對簡便。側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)重要組成部分,但它對細胞膜、胞質(zhì)合作、核膜的折射率更為敏感勃勃生機,也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。熒光信號主要包括兩部分:
O致用戶體驗、僮园l(fā)熒光提供有力支撐,即不經(jīng)熒光染色,細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光;
〗ㄗh、谔卣鳠晒馄仿?,即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光,其熒光強度較弱不斷發展,波長也與照射激光不同積極影響。自發(fā)熒光信號為噪聲信號,在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量緊密協作。在免疫細胞化學(xué)等測量中越來越重要,對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說,如何提高信噪比是個關(guān)鍵發揮重要作用。一般說來醒悟,細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子(例核黃素數據顯示、細胞色素等)的含量越高,自發(fā)熒光越強;培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高能運用,自發(fā)熒光越強;細胞樣品中所含亮細胞的比例越高達到,自發(fā)熒光越強。